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RIG-I蛋白与TRIM25蛋白的相互作用研究

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RIG-I蛋白与TRIM25蛋白的相互作用研究
论文目录
 
摘要第1-5页
Abstract第5-13页
1 前言第13-35页
  1.1 天然免疫系统第13-18页
    1.1.1 免疫系统简介第13页
    1.1.2 天然免疫抗病毒的主要途径简介第13-15页
    1.1.3 RLRs介导的抗病毒信号通路第15-18页
  1.2 RIG-I信号通路的介绍第18-25页
    1.2.1 RIG-I蛋白的介绍第18-19页
    1.2.2 RIG-I识别的配体第19-20页
    1.2.3 RIG-I的信号转导第20-21页
    1.2.4 RIG-I的调控机制第21-25页
      1.2.4.1 RIG-I的自抑制作用第21-22页
      1.2.4.2 RIG-I的转译后调控第22-25页
  1.3 TRIM25蛋白及其在RIG-I信号通路中的功能第25-28页
    1.3.1 TRIM蛋白家族第25-27页
    1.3.2 TRIM25参与的RIG-I信号通路的调控第27-28页
  1.4 结构生物学第28-34页
    1.4.1 结构生物学简介第28-29页
    1.4.2 X射线晶体学第29-31页
      1.4.2.1 X射线简介第29页
      1.4.2.2 蛋白质纯化,结晶及优化第29-31页
    1.4.3 核磁共振技术在蛋白结构域功能研究中的应用第31-34页
      1.4.3.1 核磁共振简介第31页
      1.4.3.2 NMR原理第31-33页
      1.4.3.3 NMR研究蛋白与配体间的相互作用第33-34页
  1.5 本课题的研究背景及意义第34-35页
2 实验材料与方法第35-52页
  2.1 实验材料第35-41页
    2.1.1 主要试剂第35-36页
    2.1.2 主要仪器第36-37页
    2.1.3 质粒、菌株及细胞第37页
    2.1.4 常用试剂的制备第37-41页
      2.1.4.1 克隆相关试剂第37-39页
      2.1.4.2 感受态细胞制备相关试剂第39页
      2.1.4.3 SDS-PAGE蛋白电泳试剂第39页
      2.1.4.4 细菌培养及蛋白表达相关试剂第39-40页
      2.1.4.5 蛋白质纯化所用试剂及缓冲液第40-41页
  2.2 实验方法第41-52页
    2.2.1 分子克隆相关实验和方法第41-45页
      2.2.1.1 引物设计第41页
      2.2.1.2 PCR扩增目的片段第41-42页
      2.2.1.3 双酶切载体第42页
      2.2.1.4 DNA片段的回收和纯化第42-43页
      2.2.1.5 LIC法构建表达质粒第43页
      2.2.1.6 定点突变第43-44页
      2.2.1.7 大肠杆菌感受态的制备第44页
      2.2.1.8 转化第44-45页
      2.2.1.9 碱裂解法提取质粒第45页
    2.2.2 重组蛋白的表达第45-47页
      2.2.2.1 重组蛋白的小量表达测试第45-46页
      2.2.2.2 重组蛋白的大量表达第46页
      2.2.2.3 重组目的蛋白的单一营养型M9培养基培养第46-47页
    2.2.3 重组蛋白的纯化第47-48页
      2.2.3.1 亲和纯化第47-48页
      2.2.3.2 凝胶过滤层析纯化第48页
    2.2.4 动态光散射法检测蛋白质状态第48-49页
    2.2.5 蛋白的结晶第49-50页
      2.2.5.1 结晶条件的初筛第49页
      2.2.5.2 结晶条件的优化第49-50页
    2.2.6 核磁共振技术(NMR)相关实验方法第50-51页
      2.2.6.1 蛋白稳定性测试第50页
      2.2.6.2 核磁共振相关实验第50页
      2.2.6.3 核磁共振化学位移扰动实验第50-51页
    2.2.7 免疫共沉淀及Western Blot第51-52页
3 实验结果与分析第52-73页
  3.1 CARDs与TRIM25 PRYSPRY的相互作用第52-64页
    3.1.1 RIG-I CARDs的表达与纯化第52-54页
    3.1.2 TRIM25 PRYSPRY的表达与纯化第54-56页
    3.1.3 Ubiquitin的表达与纯化第56-57页
    3.1.4 RIG-I CARDs与TRIM25 PRYSPRY的共结晶实验第57页
    3.1.5 RIG-I CARDs与TRIM25 PRYSPRY的相互滴定实验第57-64页
      3.1.5.1 蛋白在M9中的表达与纯化第57-58页
      3.1.5.2 RIG-I CARDs滴定~(15)N标记的TRIM25 PRYSPRY实验第58-61页
      3.1.5.3 免疫共沉淀实验及Western Blot第61-63页
      3.1.5.4 TRIM25 PRYSPRY滴定~(15)N标记的RIG-I CARDs实验第63-64页
  3.2 RIG-I CARD2与TRIM25 PRYSPRY的相互作用第64-68页
    3.2.1 RIG-I CARD2的表达与纯化第64-66页
    3.2.2 RIG-I CARD2与TRIM25 PRYSPRY的共结晶实验第66页
    3.2.3 RIG-I CARD2与TRIM25 PRYSPRY的相互滴定实验第66-68页
  3.3 RIG-I CARD1的~1H-~(15)N相关HSQC谱第68-73页
    3.3.1 RIG-I CARD1的表达与纯化第68-70页
    3.3.2 RIG-I CARD1动态光散射实验第70-71页
    3.3.3 RIG-I CARD1的~1H-~(15)N相关HSQC谱采集第71-73页
4 总结第73-76页
参考文献第76-85页
致谢第85页

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